imki

imki
lambang imki

Kamis, 17 November 2011

PROTEIN


  1. Pengertian protein

       Protein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling utama") adalah yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung karbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus.
(http://id.wikipedia.org/wiki/protein)
       Protein merupakan ikatan antara asam amino yang membentuk rantai yang panjang. Ikatan antara asam aminotersebut dinamakan ikatan peptide. Ikatan peptide merupakan ikatan antara dua asam amino dimana gugusan karboksil dan ikatan amina dari dua asam amino yang berlainan bereaksi.
(Yul Iskandar.1974.hal.196)
TERBENTUKNYA PROTEIN
                                        Peptide bond   
Asam amino 1        Asam amino 2                               (dipeptida)

Struktur molekul protein


B. Struktur Protein
1. Penetapan struktur protein
Rangkaian asam-asam amino dalam protein dinyatakan sebagai struktur primer. Untuk menetapkan struktur primer suatu polipeptida atau protein, maka tipe-tipe asam amino yang eksis sebagaimana juga kwantitas masing-masing tipe pertama-tama harus ditetapkan. Hal ini bisa diselesaikan dengan hidrolisis sempurna, yang diikuti oleh pemisahan dan identifikasi konsttuen-konstituen dari hidrolisat (produk hidrolisis). Hal ini, dengan sendirinya menjadi tugas yang monumental, mengingat kompleksita protein-protein;akan tetapi, teknik-teknik kromatgrafi gas dan cair dan pemisahan oleh penukaran ion telah dikembangkan dan diperbaiki akhir-akhir ini sehingga analisator asam amino otomatis yang mempu mengerjakan tugas tersebut dengan cepat dan akurat sekarang tersedia secara komersial.
Untuk menetapkan rangkaian asam amino tersebut, polimer ini kemudian dihidrolisis secara parsial untuk membentuk campuran peptide yang mengandung sejumlah kecil asam amino, dan rangkaian dalam peptide tersebut ditetapkan secara bertahap. Proses ini membutuhkan metode-metode untuk penetapan asam amino terminal-N dan terlminal-C. mari kita ilustrasikan hal ini dengan memakai tripeptida sederhana sebagai suatu contoh. Kita asumsikan bahwa hidrolisis sempurna tripeptida tersebut menghasilkan glisin (Gly), fenilalanin (Phe) dan valin (Val). Maka tripeptida tersebut bisa memiliki enam struktur yang mungkin:
Gly-Phe Val
Gly –Val- Phe
Phe-Gly-Val
Phe-val-GlY
Val-Gly-Phe
Val-Phe-Gly
Selanjutnya kita asumsikan bahwa struktur pertama dari enam yang mungkin adalah struktur yang benar.

Salah satu pereaksi yang umum dipakai untuk menetapkan asam amino terminal-N adalah 2,4-dinitrofluorobenzena (pereaksi sanger). Selama bereaksi dengan pereaksi ini, atom fluor menjalani pergantian nukleofilik oleh gugus amino bebas. Tripeptida termodifikasi ini kemudian dihidrolisis , produk-produknya dipisahkan, dan asam aminonya yang sekarang dimodifikasi dengan 2,4-dinitroflourobenzena (bisa dengan mudah diidentifikasi dengan kromatografi karena warnaya kuning) kemudian ditentukan. Enzim karboksipeptidasa mengkatalis dengan efektif reaksi pembelahan hidrolitik pada ujung terminal-C dari peptide tersebut. Dengan demikian asam amino

Terminal-C bisa diidentifikasi dengan segera. Sekali asam amino terminal-N dan terminal-C diidentifikasi, maka akan diketahui rangkaian tripeptidanya.
Sekarang mari kita pikirkan kasus suatu heksapeptida yang berstruktur:
Gly-ala-gly-Phe-Val-Leu
Tahap-tahap berikut akan menetakan strukturnya:
  1. hidrolisis  sempurna untuk menetapkan asam-asam amino mana dan berapa jumlah yang ada dari masing-masing asam tersebut;
  2. identifikasi asam-asam amino terminal-N dan-C sebagaimana yang baru saja digambarkan diatas;
  3. hidroloisis parsial yang diikuti oleh pemisahan empat tripeptida yang mungkin;
  4. penetapan rangkaian dari sembarang dua diantara tripeptida-tripeptida tersebut.
(Malcom p. steven.1989.hal:610-611)
2. konformasi
Dalam rangka untuk memahami fungsi protein, kita perlu tahu sesuatu tentang konformasi, atau pola lipat tiga-dimensi, yang rantai polipeptida mengadopsi. Meskipun banyak asam polyamino buatan tidak memiliki konformasi yang jelas dan tampaknya ada dalam larutan sebagai gulungan hampir acak, kebanyakan protein biologis mengadopsi struktur yang jelas. Beberapa, seperti keratins rambut dan bulu, yang berserat dan disusun dalam struktur linier atau sheetlike dengan pola, teratur lipat mengulangi. Lainnya, seperti kebanyakan enzim, dilipat menjadi kompak, hampir bulat, konformasi berbentuk bulat.
Struktur berserat dari keratin cukup teratur untuk menyebarkan sinar x dengan cara yang mengungkapkan keteraturan lipat. Mengukur intensitas dan posisi bintik-bintik pada pola difraksi sinar x  yang dihasilkan memberikan perkiraan jarak antara  kemampuan mengulang teratur dari pola lipat.
Linus Pauling dan Robert Corey pertama kali menyadari bahwa ikatan peptida adalah planar dan kaku. Dengan pembatasan struktural, jumlah pola lipat yang tersedia untuk protein terbatas pada dua bentuk dasar. Salah satunya berhubungan dengan pola α, sebuah pola difraksi sinar x diamati dengan keratin dari rambut, yang lain berhubungan dengan pola β, diamati dengan serat sutra, protein berserat sutra, dan dengan keratin yang telah ditarik.
Mengingat jari-jari atom van der waals yang normal, sudut ikatan yang diharapkan, dan bentuk planar ikatan peptida, hanya dua reguler, struktur mengulang ada tanpa distorsi dan dengan pembentukan ikatan hidrogen-maksimum

D. Reaksi Analisa Protein

Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu:
a. Analisa Kualitatif
1. Reaksi Xantoprotein
Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning apabila dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang terdapat pada molekul protein. Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung tirosin, fenilalanin dan triptofan.
2. Reaksi Hopkins-Cole
Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air.
Larutan albumin sebanyak 2 mL ditambahkan dengan 2 mL reagen Hopkins-Cole. Lalu, ditambahkan lagi dengan larutan asam sulfat pekat melalui sisi tabung sampai kira-kira 5 mL dan bila perlu putar perlahan-lahan. Warna yang terbentuk pada pertemuan kedua cairan diamati.kemudian Masing-masing 2 mL larutan tyrosin, phenilalanin, tripthopan, glisin dan sistein ditambahkan dengan 2 mL reagen Hopkins-Cole. Lalu, ditambahkan lagi dengan larutan asam sulfat pekat melalui sisi tabung sampai kira-kira 5 mL dan bila perlu putar perlahan-lahan. Warna yang terbentuk pada pertemuan kedua cairan diamati.
Reagen Hopkins-Cole mengandung asam glioksilat (HOO-CHO). Jika reagen tersebut ditambahkan dengan senyawa yang mengandung cincin indol dan ditambahkan dengan asam sulfat maka akan membentuk cincin ungu pada interfase kedua cairan tersebut.. Pada pengujian asam amino dengan uji Hopkins-Cole, larutan albumin ditambahkan dengan reagen Hopkins-Cole dan asam sulfat. Penambahan tersebut menyebabkan terbentuknya dua lapisan dan terbentuk cincin ungu pada bidang batas antara kedua lapisan tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa di dalam larutan albumin positif mengandung triptofan, karena triptofan merupakan satu-satunya asam amino yang mengandung gugus indol. Cincin ungu yang terbentuk merupakan hasil kondensasi triptofan dengan gugus aldehida dari asam glioksilat dalam suasana asam sulfat.
Untuk membuktikan bahwa dalam larutan albumin terdapat asam amino triptofan, maka dilakukan uji terhadap beberapa asam amino standar yang ada di laboratorium. Asam amino standar yang digunakan adalah Fenilalanin, tirosin, glisin, sistein dan triptofan. Pada pengujian dengan fenilalanin, tirosin, glisin dan sistein, tidak terjadi perubahan dan tidak terbentuk cincin ungu setelah asam-asam amino tersebut ditambahkan dengan reagen Hopkins-Cole dan asam sulfat. Hal tersebut terjadi karena kekempat asam amino tersebut tidak mengandung gugus indol. Pada pengujian dengan triptofan, terbentuk dua lapisan dan terbentuk cincin ungu di tengah-tengahnya setelah penambahan reagen Hopkins-Cole dan asan sulfat. Hal ini membuktikan bahwa di dalam larutan albumin terdapat asam amino triptofan.
3. Reaksi Millon
Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan ke dalam larutan protein yang mengandung asam amino dengan rantai samping gugus fenolik, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan.
Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat, bila direaksikan dengan senyawa yang mengandung gugus fenol akan membentuk endapan merah dengan pemanasan. Pada pengujian asam amino dengan uji Millon, larutan protein (albumi telur) ditambahkan dengan reagen Millon. Penambahan reagen Millon ini menyebabkan terbentuknya endapan putih yang kemudian berubah menjadi endapan merah. Hal ini membuktikan dalam larutan albumin tersebut positif mengandung tirosin.
Endapan putih yang terbentuk setelah penambahan reagen Millon pada larutan protein tersebut berasal dari endapan merkuri, dimana pada awalnya Hg yang terlarut di dalam HNO3 teroksidasi menjadi Hg+. Ion Hg + ini selanjutnya membentuk garam dengan gugus karboksil dari tirosin.
 Endapan putih dari garan proteinat
Ketika dipanaskan endapan putih tersebut berubah menjadi endapan merah. Hal ini terjadi karena asam nitrat yang semula berfungsi sebagai pelarut mengoksidasi Hg + menjadi Hg2+. Bersamaan dengan hal tersebut, asam amino tirosin ternitrasi. Kemudian terjadi reaksi pembentukan HgO yang berwarna merah.
Untuk membuktikan bahwa dalam larutan albumin terdapat asam amino tirosin, maka dilakukan uji terhadap beberapa asam amino standar yang ada di laboratorium. Asam amino standar yang digunakan adalah fenilalanin, tirosin, glisin, sistein dan tiptofan. Pada pengujian dengan fenilalanin, glisin, sistein dan tiptofan tidak terbentuk endapan merah. Hal ini disebabkan karena pada keempat asam amino tersebut tidak mengandung gugus fenol. Pada pengujian dengan tirosin, setelah penambahan reagen Millon dan pemanasan tidak terjadi perubahan warna. Padahal, seharusnya terbentuk endapan merah yang dapat membuktikan bahwa dalam laruta albumin terdapat asam amino tirosin. Hal ini kemungkinan terjadi karena penambahan reagen Millon yang terlalu banyak.

4.
Reaksi Natriumnitroprusida
Pada asam amino sistein, selain terdapat gugus –COOH ,gugus –NH2 dan gugus R pada asam amino sistein juga terdapat –SH bebas (gugus sulfidril) bila bereaksi dengan natrium nitroprusida dalam amonia berlebih menghasilkan kompleks berwarna merah. Beberapa protein yang memberikan hasil negatif terhadap uji ini, ternyata menjadi positif setelah dipanaskan sampai mengalami koagulasi atau denaturasi. Hal ini menunjukkan proses tersebut menghasilkan gugus –SH bebas.
Reaksi:
[Fe3+(CN)3NC]2- + NH3 + RSH        NH4+ + [Fe2+ (CN)5NOSR]2-
                        Kompleks berwarna merah
5. Metode Biuret
Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawasenyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet.
No.
Zat Uji
Hasil Uji Biuret
Polipetida (+/-)
1
Albumin 2 %
Berwarna Ungu
+
2
Gelatin 2%
Berwarna Violet
+
3
Kasein 0.5%
Berwarna Ungu
+
4
Glisin 2%
Berwarna Biru
-

    Polipeptida mempuyai perbedaan dengan protein. Polipeptida mempunyai residu asam amino ≤ 100 dan dan bobot mulekul ≤ 6.000. Sedangkan, pada protein residu asam amnionya ≥ 100 dan bobot mulekulnya ≥ 6.000. Pada praktikum ini, zat uji Glisin menunjukkan hasil negatif dengan indikasi terbentuknya warna biru adalah karena tidak adanya ikatan peptida. Glisin adalah salah satu asam amino esenial dengan rumus bangun NH2—CH2CO2H. Sedangkan pada Albumin, Gelatin dan Kasein rumus bangunya lebih kompleks dan mengikat dua atau lebih asam amino esensial , sehingga terbentuk ikatan peptida.





    Berikut gambaran proses pembantukan ikatan peptida :
Ikatan peptida
   NH2                                                                      NH2

C=O                      C=O

NH2                          NH
  NH2                                                NH3  +

C=O                      C=O

   NH2                          NH2









    Jadi, ikatan peptida hanya terbentuk apabila ada dua atau lebih asam amino esensial yang bereaksi.

b. Analisa Kuantitatif
1. Metode Kjeldahl
Metode ini merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein, dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan alkali dengan kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi.
Analisa protein cara Kjeldahl pada dasarnya dapat dibagi menjadi tiga tahapan yaitu proses destruksi, proses destilasi dan tahap titrasi.
1. Tahap destruksi
Pada tahapan ini sampel dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga terjadi destruksi menjadi unsur-unsurnya. Elemen karbon, hidrogen teroksidasi menjadi CO, CO2 dan H2O. Sedangkan nitrogennya (N) akan berubah menjadi (NH4)2SO4. Untuk mempercepat proses destruksi sering ditambahkan katalisator berupa campuran Na2SO4 dan HgO (20:1). Gunning menganjurkan menggunakan K2SO4 atau CuSO4. Dengan penambahan katalisator tersebut titk didih asam sulfat akan dipertinggi sehingga destruksi berjalan lebih cepat. Selain katalisator yang telah disebutkan tadi, kadang-kadang juga diberikan Selenium. Selenium dapat mempercepat proses oksidasi karena zat tersebut selain menaikkan titik didih juga mudah mengadakan perubahan dari valensi tinggi ke valensi rendah atau sebaliknya.
2. Tahap destilasi
Pada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH3) dengan penambahan NaOH sampai alkalis dan dipanaskan. Agar supaya selama destilasi tidak terjadi superheating ataupun pemercikan cairan atau timbulnya gelembung gas yang besar maka dapat ditambahkan logam zink (Zn). Ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap oleh asam khlorida atau asam borat 4 % dalam jumlah yang berlebihan. Agar supaya kontak antara asam dan ammonia lebih baik maka diusahakan ujung tabung destilasi tercelup sedalam mungkin dalam asam. Untuk mengetahui asam dalam keadaan berlebihan maka diberi indikator misalnya BCG + MR atau PP.
3. Tahap titrasi
Apabila penampung destilat digunakan asam khlorida maka sisa asam khorida yang bereaksi dengan ammonia dititrasi dengan NaOH standar (0,1 N). Akhir titrasi ditandai dengan tepat perubahan warna larutan menjadi merah muda dan tidak hilang selama 30 detik bila menggunakan indikator PP.
%N = × N. NaOH × 14,008 × 100%
Apabila penampung destilasi digunakan asam borat maka banyaknya asam borat yang bereaksi dengan ammonia dapat diketahui dengan titrasi menggunakan asam khlorida 0,1 N dengan indikator (BCG + MR). Akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna larutan dari biru menjadi merah muda.
%N = × N.HCl × 14,008 × 100 %
Setelah diperoleh %N, selanjutnya dihitung kadar proteinnya dengan mengalikan suatu faktor. Besarnya faktor perkalian N menjadi protein ini tergantung pada persentase N yang menyusun protein dalam suatu bahan.

2. Metode Titrasi Formol
Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan formalin akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang digunakan adalah p.p., akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik.

Selain cara diatas,kita dapat juga dianalisis untuk menentukan kadar protein dengan:

  1. Penetapan Kadar Protein dengan Metode FeCl3

Protein dapat diendapkan dengan asam tannat. Kompleks asam tannat/protein yang terjadi dapat bereaksi dengan ion Ferri membentuk kompleks stabil berwarna merah. Sebelumnya, kelebihan asam tannat harus dihilangkan dengan pencucian menggunakan larutan NaCl fisiologis. Metode ini mempunyai kelebihan: cepat, mudah dikerjakan, dan akurat. Metode ini bisa memiliki batas deteksinya hingga 5 ug/mL, dan recovery 98-103%. Interferensi yang bisa terjadi pada metode ini adalah bila terdapat senyawa yang bisa membentuk kompleks dengan ion Ferri.

Reagen:

  • Larutan NaCl 1.5 M
  • Asam Tannat 1 mM; dibuat dengan melarutkan 1.7 g asam tannat dalam akuades (yang mengandung 1 g asam benzoat) hingga 1 L.
  • Larutan FeCl3 10 mM; dibuat dengan melarutkan 1.625 g dalam pelarut air-trietanolamin (1:1) hingga 1 L.

Larutan Standard:

Buat seri kadar larutan standard BSA (Bovine Saline Albumin) 0.1 - 1.0 mg/mL dengan pengenceran dari larutan stok.

Prosedur:

  1. Ambil 0.5 mL larutan (sampel protein/standard), masukkan ke dalam tabung sentrifuse. Tambahkan 0.5 mL larutan NaCl 1.5 M dan 0.5 mL asam tannat 1 mM, vortex. Setelah 5 menit, lakukan sentrifugasi selama 10 menit pada 3000 rpm.
  2. Dekantir supernatan, tuntaskan dengan membalikkan tabung pada kertas saring.
  3. Tambahkan 5 mL larutan NaCl pada endapan, vortex, sentrifugasi, dan buang supernatan untuk memcuci endapan.
  4. Tambahkan 2 mL air dan 0.5 mL reagen FeCl3 pada endapan, vortex. Setelah 5 menit, ukur absorbansinya pada 510 nm terhadap blanko (2 mL air + 0.5 mL FeCl3).
  1. Penetapan Kadar Protein dengan Metode Lowry

Metode Lowry merupakan pengembangan dari metode Biuret. Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat-phosphotungstat (phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropolymolybdenum blue akibat reaksi oksidasi gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif yang dapat dideteksi secara kolorimetri. Kekuatan warna biru terutama bergantung pada kandungan residu tryptophan dan tyrosine-nya. Keuntungan metode Lowry adalah lebih sensitif (100 kali) daripada metode Biuret sehingga memerlukan sampel protein yang lebih sedikit. Batas deteksinya berkisar pada konsentrasi 0.01 mg/mL. Namun metode Lowry lebih banyak interferensinya akibat kesensitifannya.
  1. Penetapan Kadar Protein dengan Metode Bradford

Metode Bradford didasarkan pada pengikatan secara langsung zat warna Coomassine Brilliant Blue G250 (CBBG) oleh protein yang mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik (Tyrosine, Tryptophan dan Phenylalanine) atau bersifat basa (Arginine, Histidine dan Leucine). Reagen CBBG bebas berwarna merah-kecoklatan (λmaks 465 nm), sedangkan dalam suasana asam reagen CBBG akan berada dalam bentuk anion yang akan mengikat protein membentuk warna biru (λmaks 595 nm). Jumlah CBBG yang terikat pada protein proporsional dengan muatan positif yang ditemukan pada protein
Metode Bradford didasarkan pada pengikatan secara langsung zat warna Coomassine Brilliant Blue G250 (CBBG) oleh protein yang mengandung residu asam amino dengan rantai samping aromatik (Tyrosine, Tryptophan dan Phenylalanine) atau bersifat basa (Arginine, Histidine dan Leucine). Reagen CBBG bebas berwarna merah-kecoklatan (λmaks 465 nm), sedangkan dalam suasana asam reagen CBBG akan berada dalam bentuk anion yang akan mengikat protein membentuk warna biru (λmaks 595 nm). Jumlah CBBG yang terikat pada protein proporsional dengan muatan positif yang ditemukan pada protein.
Coomassie Blue G250; sebanyak 100 mg Coomassie Blue G250 dilarutkan dalam 50 mL etanol 95%. Larutan ini kemudian dicampur dengan 100 mL asam fosfat 85%, diencerkan hingga 1 L dengan akuades. Reagen kemudian disaring dengan kertas Whatman No. 1 sebelum disimpan pada suhu kamar. Reagen ini stabil untuk beberapa minggu, meskipun akan terjadi sedikit pengendapan.
Buat seri kadar larutan standard BSA (Bovine Saline Albumin) 0.1 - 1.0 mg/mL dengan pengenceran dari larutan stok.Ambil 100 μL larutan (sampel/standard), masukkan ke tabung. Tambahkan 5 mL reagen, homogenkan. Hindari terjadinya gelembung (busa), Ukur absorbansi pada 595 nm terhadap blanko (larutan PBS).

Sumber:
(http://ariebs.staff.ugm.ac.id/?tag=analisis-protein)
(Philip w. kuchel.1985.hal:81-84)

0 komentar:

Poskan Komentar

 
Design by Free WordPress Themes | Bloggerized by Lasantha - Premium Blogger Themes | cheap international calls