REAKSI KIMIA DAN ANALISIS ASAM AMINO

1.Analisa asam Amino
Analisa asam amino terbagi menjadi 2 yaitu :

1. Analisa kualitatif
2. Analisa kuantitatif

Analisa kualitatif adalah suatu analisa yang bersifat induktif dan berkelanjutan yang tujuan akhirnya menghasilkan pengertian-pengertian, konsep-konsep dan pembangunan suatu teori baru.Atau dengan kata lain analisa kualitatif adalah analisa berdasarkan apa yang kita lihat atau kita amati.  Misalnya uji asam amino dalam sampel makanan dengan menggunakan reaksi spesifik ninhidrin. Lalu mengamati warna-warna yang dihasilkan dari percobaan pengamatan tersebut. Untuk hasil positif mengandung asam amino yaitu menghasilkan warna ungu.Hasil warna merupakan hasil analisa kualitatif.

Analisa kuantitatif adalah suatu analisa yang  bersifat deduktif, uji empiris teori yang dipakai dan dilakukan setelah selesai pengumpulan data secara tuntas dengan menggunakan sarana statistic. Misalnya untuk menjawab pertanyaan berapa kadar asam amino yang terkandung dalam sampel makanan tersebut ? . Penentuan kadar merupakan analisa kuantitatif.   

          Tahap pertama dalam menentukan struktur suatu protein tertentu adalah dengan menghirolisa protein itu menjadi komponen asam amino nya , lalu menentukan jumlah tiap- tiap asam amino. Untuk memisahkan, mengidentifikasi dan mengukur secara kuantitatif jumlah tiap- tiap asam amino di dalam campuran, diperlukan metoda yang dapat mempermudah hal ini, terutama elektroforesis dan khromatografy penukaran ion . Kedua metoda ini memanfaatkan perbedaan dalam tingkah laku asam-basa dari asam amino yang berbeda , yakni perbedaan dalam tanda dan besar muatan listrik total pada pH tertentu, yang dapat diduga dari nilai pK’ dan kurva titrasi.

Namun masih terdapat lagi metoda  kromatografi yang dapat digunakan dalam melakukan uji kualitatif asam amino yaitu kromatografi kertas dan kromatografi lapis tipis. Namun untuk kromatogarafi lapis tipis dan kromatografi penukaran ion juga termasuk kedalam analisa kuantitatif.

Elektroforesis Kertas Memisahkan Asam- Amino Berdasarkan Muatan Listrik

    Metoda yang paling sederhana untuk memisahkan asam amino adalah elektroforesis kertas. Setetes larutan dari campuran asam amino ditempatkan pada selembar kertas filter yang telah dibasahi oleh buffer pada pH tertentu. Medan listrik dengan tegangan tinggi diberikan pada kertas tersebut. Karena perbedaan nilai pK’, asam amino akan bermigrasi menuju arah yang berbeda dan pada kecepatan yang berbeda disepanjang kertas, tergantung pada pH system buffer dan tegangan listrik yang dipergunakan . Contoh nya pada pH 1,0, histidin, arginin, dan lisin mempunyai muatan +2 dan bergerak lebih cepat menuju katoda bermuatan negative dibandingkan dengan asam amino lainnya yang mempunyai muatan +1. Pada pH 6,0 , asam amino bermuatan positif (lisin, arginin, histidin)bergerak menuju katoda , dan asam amino bermuatan negative (asam aspartat dan asam glutamate) menuju anoda. Semua asam amino lain akan tinggal pada atau dekat titik asal, karena senyawa ini tidak mempunyai gugus mengion selain dari gugus α-amino dan α-karboksil, dan karenanya , mempunyai  titik isoelektrik yang hampir sama seperti ditentukan dari nilai pK’1 dan  pK’2 . Untuk menetapkan letak asam amino pada kertas, dilakukan pengeringan dan penyemprotan dengan nihidrin dan pemanasan. Spot warna biru atau ungu, masing- masing menunjukkan adanya asam amino, akan muncul pada kertas.

Kromatografi Penukar Ion Merupakan Proses pemisahan yang Lebih Berguna
    Kromatografi penukar ion merupakan metoda yang paling banyak digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi dan menghitung jumlah tiap-tiap asam amino didalam suatu campuran . Metoda ini memanfaatkan perbedaan dalam tingkah laku asam-basa dari asam amino. Kolom kromatografi terdiri dari tabung panjang yang diisi dengan granula resin sintetik yang mengandung gugus yang bermuatan tetap. Resin dengan gugus anion tertentu disebut resin penukar kation,resin dengan gugus kation tertentu disebut resin penukar anion . dalam bentuk kromatografi penukar ion yang paling sederhana , asam amino dapat dipisahkan pada kolom resin penukar kation. Dalam hal ini, gugus anion terikatnya, misalnya gugus asam sulfonat (‒SO3- ), pertama-tama diberi bermuatan dengan Na+. Larutan asam (pH 3,0 ) dari campuran asam amino yang akan dianalisa dituangkan ke dalam kolom dan dibiarkan tersaring secara berlahan-lahan. Pada pH 3,0 sebagian besar asam amino berbentuk kation dengan muatan total positif, tetapi senyawa ini berbeda didalam tingkat mengionnya. Pada saat campuran mengalir melalui kolom, asam amino bermuatan positif akan menukar ion Na+, yang berikatan dengan gugus tetap ‒SO-3 pada partikel resin. Pada pH 3,0 asam amino yang bermuatan paling positif ( lisin, arginindan histidin) akan menukar Na+, pertama-tama dari resin, lalu akan terikat paling kuat pada resin.

    Asam amino yang pada pH 3,0 bermuatan positif paling kecil ( asam glutamat dan asam aspartat) akan terikat paling lemah. Semua asam amino yang lain akan mempunyai muatan positif diantara kedua ekstrim. Asam amino yang berbeda , akan bergerak ke bawah kolom resin pada kecepatan yang berbeda , yang tergantung terutama pada nilai pK’, tetapi juga sebagian bergantung pada adsorpsi atau kelarutannya di dalam partikel resin. Asam glutamat dan aspartat akan bergerak ke bawah kolom pada kecepatan paling tinggi , karena ikatan senyawa ini dengan resin paling lemah pada pH 3,0 sedangkan lisin, arginin, dan histidin akan bergerak paling lambat . Fraksi- fraksi kecil pada beberapa milliliter, masing- masing akan dikumpulkan dari bagian bawah kolom dan dianalisa secara kuantitatif . Seluruh prosedur tlah di otomasikan, sehingga pencucian, pengumpulan fraksi, analisa tiap fraksi , dan pencatatan data dilakukan secara otomatis didalam analisa asam amino.

Gambar dibawah ini memperperlihatkan kromatografi dari campuran asam amino

Gambar.kromatografi kolom

    Kromatografi kertas sebagai penyerap digunakan sehelai kertas dengan susunan serabut dan tebal yang sesuai. Mekanisme pemisahan dengan kromatografi kertas prinsipnya sama dengan mekanisme pada kromatografi kolom. Adsorben dalam kromatografi kertas adalah kertas saring, yakni selulosa. Sampel yang akan dianalisis ditotolkan ke ujung kertas yang kemudian digantung dalam wadah. Kemudian dasar kertas saring dicelupkan kedalam pelarut yang mengisi dasar wadah. Fasa mobil (pelarut) dapat saja beragam. Air, etanol, asam asetat atau campuran zat-zat ini dapat digunakan.
Kromatografi kertas diterapkan untuk analisis campuran asam amino dengan sukses besar. Karena asam amino memiliki sifat yang sangat mirip, dan asam-asam amino larut dalam air dan tidak mudah menguap (tidak mungkin didistilasi), pemisahan asam amino adalah masalah paling sukar yang dihadapi kimiawan di akhir abad 19 dan awal abad 20. Jadi penemuan kromatografi kertas merupakan berita sangat baik bagi mereka.
Kromatografi kertas dua-dimensi (2D) menggunakan kertas yang luas bukan lembaran kecil, dan sampelnya diproses secara dua dimensi dengan dua pelarut.

Kromatografi lapis tipis digunakan untuk memisahkan komponen-komponen atas dasar perbedaan adsorpsi atau partisi oleh pase diam dibawah gerakan pelarut pengembang. Pada dasarnya KLT sangat mirip dengan kromatografi kertas , terutama pada cara pelaksanaannya. Perbedaan nyatanya terlihat pada fase diamnya atau media pemisahnya, yakni digunakan lapisan tipis adsorben sebagai pengganti kertas.

Bahan adsorben sebagai fasa diam dapat digunakan silika gel, alumina dan serbuk selulosa. Partikel selika gel mengandung gugus hidroksil pada permukaannya yang akan membentuk ikatan hidrogen dengan molekul polar air. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.

3. REAKSI KIMIA SPESIFIK ASAM AMINO

    Reaksi asam amino mencirikan gugus fungsional yang terkandung. Semua asam amino mengandung gugus aminodan karboksil. Senyawa ini akan memberikan reaksi kimia yang mencirikan gugus-gugus ini . Sebagai contoh , gugus amino dapat memberikan reaksi asetilasi dan gugus karboksil esterifikasi.

1. REAKSI GUGUS KARBOKSIL

1. Gugus karboksil suatu asam amino dapat membentuk ester dengan adanya alcohol

2. Dalam sebuah molekul protein, gugus karboksil suatu asam amino berikatan dengan gugus amino dari asam amino lainnya melalui ikatan peptida.

Dalam sel hidup, sintesisikatan peptida ini melalui jalan yang rumit, namun untuk mudahnya dapat digambarkan sebagai berikut :

Suatu peptida yang terdiri dari dua atau lebih ikatan peptida bereaksi dengan Cu2+ dalam larutan basadan membentuk kompleks berwarna biru- ungu. Reaksi ini dikenal dengan sebagai reaksi Biuret, dan merupakan dasar dari penentuan protein secara kuantitatif.

3. Dekarboksilasi gugus karboksil

Gugus karboksil asam amino dapat terdekarboksilasi baik secara kimia maupun secara biologis sehingga terbentuk amina. Contohnya adalah pembentukan histamin dan histidin. Histamin merangsang pengaliran cairan gastrium ke usus besar dan terlibat dalam reaksi alergi.

2. REAKSI GUGUS AMINA

1. Reaksi dengan HNO2

Gugus amina dapat bereaksi dengan zat pengoksidasi kuat HNO2 untuk melepaskan N2 yang kemudian dapat ditentukan secara manomerik.

Reaksi ini dipakai untuk perkiraan jumlah gugus α-amina yang terdapat pada asam amino, peptida , atau protein. Tetapi asam amino prolin dan hidroksil prolintidak dapat bereaksi dengan HNO2 sedangkan gugus α-amina pada lisin hanya dapat bereaksi secara lamban . Reaksi ini menjadi dasar dari cara penentuan protein kasar pada metoda Kjeldahl.

2. Reaksi nindidrin

Gugus amina dapat bereaksi dengan pereaksi ninhidrin membentuk amonia , CO2, dan aldehida. Reaksi ninhidrin dipakai sebagai dasar untuk penentuan kuantitas asam amino. Warna biru menunjukkan secara khas gugus amino. Tetapi prolin dan hidroksi prolin yang mempunyai gugus amina sekunder menghasilkan warna kuning. Sedang asparagin yang mengandung gugus amida bebas bereaksi membentuk warna cokelat. pada kondisi yang sesuai intensitas warna yang dihasilkan dapat dipergunakan untuk mengukur konsentrasi asam amino secara kalorimetrik. Metoda ini sangat sensitif pada pengukuran konsentrasi.

3. Reaksi dengan 1-fluoro-2,4-dinitrobenzena ( FDNB )

Dalam reaksi ini terbentuk derivat asam amino 2,4-dinitrofenil yang berwarna kuat. Senyawa FDNB bereaksi dengan gugus aminoyang bebas pada ujung NH2- terminal suatu polipeptida , dengan gugus E-amino dari asam amino lisin begitu juga gugus amino dalam asam amino bebas. Alian

4. Reaksi dengan dansil klorida

Gugus amina pada asam amino atau pada peptida bereaksi dengan dansil klorida ( 1-dimetilaminonaftalen klorida ) membentuk derivat asam amino dansil. Gugus dansil ini berfluoresensi sehingga asam amino yang sangat sedikit dapat ditentukan dengan cara ini.

5. Reaksi dengan formal dehida ( Sӧrenson formal titration )

Formaldehida menutup gugus amino dan membentuk kompleks asam amino formaldehida, sehingga gugus karboksilnya yang bebas dapat didititrasi. Indikator yang dipakai adalah fenolftalein dan timolftalein.

6. Diantara reaksi gugus aminoyang sangat penting adalah reaksi yang ditemukan oleh Edman. Dia telah mencoba memodifikasi reaksi isotianat dengan amina demikian rupa sehingga modifikasi ini dapat dipakai untuk degradasi rantai polipeptida dan untuk identifikasi terminal –NH2 pada peptida. Dalam prosedur edman ini, fenilisotiosianat bereaksi dengan α-asam amino membentuk asam amino feniltiokarbamoil. Jika diberi larutan nitrometan, asam amino feniltiokarbamoilberubah menjadi bentuk siklik yaitu feniltiohidantoin. Senyawa ini tidak berwarna, dapat dipisahkan dengan mudah dan kemudian diidentifikasikan dengan kromatografi. Reaksi edman sering digunakan untuk identifikasi terminal NH2 asa amino suatu polipeptida.

3. REAKSI GUGUS R

Beberapa asam amino mempunyai gugus R yang dapat mengion. Contohnya  ialah sistein, tirosin, dan histidin. Reaksi lain yang sangat penting adalah secara biologis ialah reaksi gugus R pada serin dan sistein.

Gugus –SH pada sistein juga dapat bereaksi secara aktif, misalnya pada pembentukan asam amino sistin. Ikatan disulfida yang berasal dari gugus –SH sistein banyak terdapat dalam protein. Misalnya pada molekul insulin yang aktif ada 3 ikatan disulfida  dimana 2 diantaranya menjadi jembatan antara 2 rantai polipeptida. Enzim ribonukleasemempunyai 4 ikatan disulfide antara 4 pasang residu sistein  dan kalau ikatan ini rusak maka enzim menjadi tidak aktif.

Sumber:
(Aisjah girindra.1990.hal:73-76)
http://pisassakienah.wordpress.com/2009/10/09/kromatografi/)
(Lehninger.1982.hal:122-125)

Posted in: Biokimia